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微生物細胞、植物細胞與動物細胞在培養上的區別

發布時間:2022-06-14      點擊次數:143
  微生物細胞培養,簡稱微生物培養,包括原核細胞培養(細菌培養)和真核細胞培養(霉菌培養和酵母培養)。這些細胞小、且具有細胞壁,細胞周期非常短,如細菌每20-30min增殖1次。
 
  植物細胞培養指原生質體培養。未考慮分離出原生質體的植物細胞培養,無論是游離的單細胞或組織塊,都稱作植物組織培養。
 
  動物組織細胞培養包括接種單細胞懸液進行的培養、接種組織塊進行的培養。傳代細胞如細胞株、細胞系,通常采用接種單細胞懸液進行的培養,是動物細胞培養常見的方式。原代細胞是指來源于動物組織的細胞團塊,往往包含多種細胞類型,并且細胞與細胞之間的細胞質膜有緊密聯系。如果培養時不需分離組織中的細胞,直接用組織塊進行的培養就是組織培養。如果需要制備成單細胞懸浮液,再接種培養,則屬于一原代細胞培養。
 
  一、細胞型微生物培養
 
  細胞型微生物包括原核細胞類微生物和真核細胞類微生物。細菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體和立克次氏體等一般屬于單細胞原核生物,放線菌是菌絲生長,其菌絲由多細胞組成,但每個細胞往往含多套核物質,屬于無隔菌絲。酵母一般是單細胞真核生物,霉菌往往是多細胞真核生物。霉菌菌絲多數時候是有隔菌絲,每個細胞一般含1個細胞核或2個以上的細胞核。
 
  (一)培養目的
 
  根據培養基物理性狀的差異,分為3種類型:①液體培養,用于增菌培養、鑒別培養等目的;②固體培養,這種培養的目的有增菌、分離、鑒別、保藏等;③半固體培養,一般用于鑒別和增菌目的。
 
  (二)培養形式
 
  在液體培養類型中,常見發酵管培養、發酵罐培養、搖瓶培養、多孔板培養等形式。在固體培養類型中,培養皿平板、克氏瓶(扁瓶)平板、試管斜面為常見形式。
 
  (三)培養儀器
 
  原核細胞培養所用的培養箱是生化培養箱或厭氧培養箱,前者用于好氧菌培養,后者用于厭氧菌培養,厭氧培養需要鋼瓶提供食品級氮氣。霉菌培養箱用于霉菌培養,能提供較高的相對濕度,氣密性也比較高。
 
  二、植物組織細胞培養
 
  植物組織培養是指通過無菌操作分離植物體的一部分,即外植體,接種到培養基上,在人工控制的條件下進行培養,使其產生完整植株的過程。植物組織培養主要有原生質體培養、懸浮細胞培養、花藥培養、組織培養、器官培養等形式,其中最常見的是愈傷組織培養。
 
  (一)培養目的
 
  由于植物細胞具有全能性,植物組織細胞培養的各種類型均可經過誘導分化形成愈傷組織,發育形成新植株。植物組織培養技術不僅用于快速繁殖,而且有著相當廣泛的用途。這些應用包括單倍體育種、種質保存、生理學研究和基因轉化等。
 
  (二)培養類型
 
  1.植物原生質體培養
 
  植物細胞培養,狹義上僅指植物原生質體培養,廣義上包括植物原生質體培養和植物組織培養。
 
  脫除細胞壁后的植物細胞稱為原生質體。植物原生質體培養是將來源于某個植物器官的組織塊中的細胞,用纖維素酶或果膠酶等降解細胞壁,離心收集得到單細胞懸液,然后接種培養。其特點是:①比較容易攝取外來的遺傳物質,如DNA;②便于進行細胞融合,形成雜交細胞;③與完整細胞一樣具有全能性,仍可產生細胞壁,經誘導分化成完整植株。
 
  2.植物組織培養
 
  包括莖尖分生組織或愈傷組織培養。其中,誘發產生的愈傷組織,在條件適宜情況下,可培養出再生植株。用于以下目的:①研究植物的生長發育、分化和遺傳變異;②進行特定品種的克隆,即無性繁殖;③制取特定植物組織細胞的代謝產物。
 
  3.懸浮植物細胞培養
 
  在愈傷組織培養技術基礎上發展起來的一種培養技術。適合于進行產業化大規模細胞培養,制取植物代謝產物。
 
  4.花藥培養
 
  也稱單倍體培養。通過花藥或花粉培養可獲得單倍體植株,經人為加倍后可得到完全純合的植株或品種。
 
  5.植物器官培養
 
  植物器官培養是指將植株的胚、花藥、子房、根或莖在體外進行的培養。
 
  (三)培養條件
 
  人工培養條件,即人工環境,包括:①提供能量來源的光照條件;②保證新陳代謝的溫度條件;③提供氣一水平衡的濕度條件;④提供生物原料來源的培養基;⑤避免環境微生物污染的無菌環境。人工環境模仿了植物的自然環境,即光照、溫度、濕度、土壤和完整植株體內無菌環境。
 
  光照、溫度的選定通常依據所培養植物的生態習性,習慣上采用暗培養與光照培養(8h/d,30001x)相結合交替進行全程的培養,溫度控制在25-28℃范圍。濕度在組織培養中不需特意地調整,因為培養容器中的相對濕度幾乎達到100%,因此,如何控制人工培養環境的重點和難點在于培養基的選擇和配制。
 
  1.培養基
 
  植物培養基是從無土栽培的營養液發展而來的,在某種意義上可理解為模擬土壤。最初的培養基是馬鈴薯浸出液,隨著植物生理學和生物化學研究的深入,培養基的構成越來越復雜,成分越來越多。
 
  當瓊脂、明膠支持物的發現并且應用到培養基中時,固體培養基隨之誕生。固體培養基是組織培養基中常用的一種培養基類型。不同的植物對培養基最適pH值的要求也是不同的,大多在5-6.5范圍,一般培養基pH控制在5.8,這基本能適應大多植物培養的需要。培養基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質可以調整滲透壓。通常1-2個大氣壓可促進植物組織生長,2個大氣壓以上時,出現生長障礙,6個大氣壓時植物組織即無法生存。無論培養目標設計是針對細胞生長還是針對代謝產物的積累,其培養基主要由碳源、有機氮源、無機鹽、植物生長激素、有機酸和一些復合物質組成。
 
  (1)碳源蔗糖或葡萄糖是常用的碳源,果糖比前兩者差。其他的碳水化合物不適合作為單一的碳源。通常增加培養基中蔗糖的含量,可增加培養細胞的次生代謝產物量。
 
  (2)有機氮源通常采用的有機氮源有蛋白質水解物(包括酪蛋白質水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有機氮源對細胞的初級培養的早期生長階段有利。L-谷氨酰胺可代替或補充某種蛋白質水解物。
 
  (3)無機鹽類大量元素和微量元素通常使用無機鹽代替,鐵鹽通常以鰲合鐵的形式出現。對于不同的培養形式,無機鹽的最佳濃度是不相同的。通常在培養基中含大量元素的無機鹽濃度控制在25mmol/L左右。硝酸鹽濃度一般采用25-40mmol/L,雖然硝酸鹽可以單獨成為無機氮源,但是加入銨鹽對細胞生長有利。如果添加一些琥珀酸或其他有機酸,銨鹽也能單獨成為氮源。培養基中必須添加鉀元素,其濃度為20mmol/L。磷、鎂、鈣和硫等微量元素的濃度在1-3mmol/L之間。
 
  (4)植物生長激素大多數植物細胞培養基中都含有天然的和合成的植物生長激素。植物激素在組織培養中具有無可動搖的核心地位,包括五大類,即生長素類、細胞分裂素類、赤霉素、乙烯類和生長抑制素類。在植物組織培養中常用的是生長素和細胞分裂素。分裂素和生長素通常一起使用,促使細胞分裂、生長。生長素在植物細胞和組織培養中可促使根的形成,有效和常用的有吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸,分裂素通常是腺嘌呤衍生物。
 
  (5)有機酸加入丙酮酸或者三羧酸循環中間產物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸,能夠保證植物細胞在以銨鹽作為單一氮源的培養基上生長,并且耐受鉀鹽的能力至少提高到10mmol/L。三羧酸循環中間產物,同樣能提高低接種量的細胞和原生質體的生長。
 
  (6)復合物質通常作為細胞的生長調節劑,如酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前這些物質已被已知成分的營養物質所替代。在許多例子中還發現,有些抽提液對細胞有毒性。目前仍在廣泛使用的是椰子汁,在培養基中濃度是1-15mmol/L。
 
  2.培養器皿
 
  培養器皿是強調植物組織細胞培養物的形態,有試管、三角燒瓶、罐頭瓶、培養皿、扁身培養瓶、凹面載玻片、L型管和T型管等種類。
 
  3.培養外環境
 
  植物組織細胞培養需要光照、溫度、濕度等條件,滿足此類條件的培養箱是光照培養箱、大型的人工氣候箱、人工氣候室或植物生物反應器。
 
  三、動物細胞培養
 
  (一)培養類型
 
  1.依據培養細胞來源動物分類
 
  分為無脊椎動物細胞培養和脊椎動物細胞培養。
 
  (1)無脊椎動物細胞培養指來源于多孔動物門、腔腸動物門、環節動物門、節肢動物門、軟體動物門和棘皮動物門的細胞培養。
 
  無脊椎動物的細胞培養研究晚于哺乳動物,由于無脊椎動物細胞在形態、結構和功能以及營養需求等方面的特殊性,其細胞培養多數停留在原代培養和有限細胞系水平上。
 
  節肢動物門可分為3個亞門7個綱,其中的甲殼綱、蛛形綱、多足綱、昆蟲綱的種類多,分布廣,某些種類可供藥用,主要代表有蝦、蟹、昆蟲。從1961年至今,已建立昆蟲細胞系800余株。
 
  (2)脊椎動物細胞培養這些脊椎動物從低級到高級包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類。
 
  脊椎動物細胞培養開展較早,細胞系建立比較完善。哺乳動物細胞培養研究起步早,研究較多,其生物學特性更接近于人體天然產物,是目前生物技術產品研究開發的重點。
 
  20世紀80年代WHO明確了哺乳動物傳代細胞可用于生物制品生產以后,該領域的細胞培養在生物技術藥物的研發中獲得了長足的發展。據文獻報道,已批準上市的生物技術藥物中70%是由哺乳動物細胞產生的。
 
  2.依據細胞生長特性分類
 
  一般分為貼壁培養和懸浮培養,參考任務三十一。
 
  3.依據培養目的分類
 
  原代培養、傳代培養、克隆化培養、擴大培養等。詳細內容和操作方法參考任務三十三。
 
  (二)培養條件
 
  1.培養基
 
  常用的有含血清培養基和無血清培養基,一般是合成培養基,有各種型別的商品培養基供應,如干粉培養基和液體培養基。含血清培養基通常使用胎牛血清、新生牛血清或小牛血清,一般添加量為5%-20%。
 
  2.培養器皿
 
  常用培養器皿包括培養皿、培養方瓶、多孔細胞培養板等種類,具體內容可閱讀任務十九和任務二十。
 
  3.培養儀器
 
  開放性的培養使用專業的CO2培養箱,為動物細胞的生長提供溫度、濕度與pH保證,其中,CO2濃度的恒定對穩定培養液的pH至關重要。
 
  除常用的CO2培養箱以外,生產中還需要動物細胞生物反應器、細胞工廠或滾瓶機等儀器或大型設備。
 
  4.鏡檢儀器
 
  倒置生物顯微鏡是不可或缺的鏡檢儀器,用于觀察培養物的生長狀況,檢查是否有微生物污染,初步判斷是何種細胞型微生物污染。
 
  四、微生物細胞、植物細胞與動物細胞在培養上的主要區別
 
  在生物技術中,人們已經利用細菌、絲狀真菌的大量培養來生產各種酶、抗生素、蛋白質、氨基酸等產物,但是很多有重要價值的生物物質,如毒素、疫苗、干擾素、單克隆抗體、色素、香味物質等,必須借助于動物細胞、植物細胞的大規模培養來制備。
 
  如果對微生物細胞、植物細胞或動物細胞在培養上的異同點有一定的了解,將幫助學習者更好地掌握動物細胞的基本條件和要求,為哺乳動物細胞培養建立一定的理論基礎。
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